基因合成基本觀念

基因合成是一個具有革命性的技術，與在細胞中發生的DNA複製及經由PCR放大不同，基因合成不需要DNA模板就能合成目標基因序列，幾乎任何序列都可以合成，包括不存在於自然界中的序列，科學家不再侷限於傳統分生克隆，可以設計或是重新編碼整個基因組來合成。

基因合成的原理

一般基因合成是由一個鹼基一個鹼基，經由化學合成方式逐步地添加而形成一條DNA鏈，這方法叫做亞磷醯胺合成法(phosphoramidite chemistry)，是常見DNA固相的合成方式，包含四個步驟:

1. 去保護基(deprotection)，將5’羥基(hydroxy group)上的保護基dimethoxytrityl(DMT)去除

2. 耦合反應(coupling)，第2個鹼基(帶有DMT)與第1個鹼基形成亞磷酸三酯鍵(phosphite triester)耦合在一起

3. 帶帽反應(capping)，少數未參與耦合反應的羥基醯化(acylation)作用，防止其後繼續發生反應

4. 氧化反應(oxidation)，耦合反應形成的亞磷酸三酯鍵並不穩定，再進行下一個循環前必須使其氧化，轉為較穩定的磷酸三酯鍵(phosphate triester)

圖一、基因合成: 亞磷醯胺合成法

重複此四個步驟直到形成一條DNA鏈，但因限制於化學反應的效率，能合成的基因片段無法太長，較不適合大規模合成。

新型合成技術

新型的合成技術是結合矩陣式及亞磷醯胺合成法來進行基因合成，可用於高通量的序列合成，目前仍在持續發展矩陣式的相關技術，未來能提供更強大且高品質的基因序列合成方法，分為四個步驟:

1. 在矩陣中合成寡核甘酸(oligonucleotide)序列
2. 次世代定序來鑑定在矩陣中合成的序列
3. 從合成片段的群集(pool)中選出要放大的片段
4. 放到子矩陣中放大並組裝成基因片段來完成基因的構築

針對高難度或特長合成序列無法一次完成，需經由基因片段組裝，常用的有三種:

1. 接合連鎖反應(ligation chain reaction, LCR)，相鄰單鏈寡核甘酸設計成有重疊且互補的片段，將這些寡核甘酸混合在一起，經由升降溫解鏈黏合使其成為雙股DNA片段，重複步驟直到有全鏈的基因序列，最後用PCR擴增
2. 相鄰的單鏈寡核甘酸在二端有一部分是重疊的互補序列，利用PCR反應形成雙股DNA，此法稱聚合酶連鎖組裝(polymerase cycle assembly, PCA)
3. 接合反應(ligation)與PCA結合，經由PCA反應組裝好的基因片段，再經接合反應直接接到載體上

針對取得多條基因序列的需求，相較於傳統多次克隆的方式，基因合成更可節省操作時間及成本，而且一般傳統做出來的質體常常蛋白表現量不高，難以進行後續實驗，不過基因合成可以透過密碼子的優化(codon optimization)來提高目標蛋白質的表現量。 基因合成流程，如圖二，將合成好的基因序列再經由克隆技術接合到載體上，可以維持插入序列在操作及保存期間較不會降解，定序驗證插入序列的正確性 。

圖二、基因合成流程(註10)

傳統克隆作法:

1. 從細胞或組織中抽取RNA，反轉錄成cDNA
2. 設計引子，利用PCR放大基因片段
3. 純化PCR產物
4. 經由限制酶剪切接合上載體
5. 完成一個質體，送入細菌中後挑出菌落
6. 定序確認序列

傳統克隆方式取得序列的瓶頸:

1. 抽出的RNA量小且不穩定
2. 需要調整PCR的最適化條件
3. 連續重複序列(tandem repeat sequence)及長片段重覆鹼基增加PCR難度
4. 純化PCR產物時，損失過多的產物
5. 接合作用效率低
6. 多次PCR產生突變
7. 難以完成密碼子優化與致突變作用序列

委託服務要點與注意事項

1. 填寫基因名稱
2. 基因序列或蛋白質序列
3. 限制酶切位的選擇: 接進載體裡需要序列兩端加上限制酶切位序列，並且不 含在目標基因序列中
4. 序列優化與否: 依照實驗目的不同選擇，序列優化可提高蛋白表現以及序列中GC含量分布均勻
5. 序列優化要避免的限制酶切位: 通常會避免要接到載體上的兩端限制酶
6. 抗生素選擇: ampicillin及kanamycin
7. 載體選擇: 穿梭載體(shuttle vector)或表現載體(expression vector)

密碼子優化(codon optimization)的重要性

研究基因功能、蛋白質結構、酵素動力或是藥物研發時，時常需要將目標蛋白大量表現，利用在宿主細胞中來表達目標蛋白的基因，而這宿主細胞與原先序列可能是不同物種，此時便會發生這基因在宿主細胞中所表達的蛋白質過低，也會因產生的蛋白過低而造成蛋白質不當的摺疊，這是因為不同物種間使用的遺傳密碼子偏好所造成的，如表一，而序列優化是指現在利用生資系統，在不改變最後轉譯出胺基酸序列的原則下，改變遺傳密碼子以突破不同物種間密碼子使用偏好的問題，這不僅提高了蛋白的表現，也提高了所產出來蛋白的正確性。

Alanine	Human	E. coli
GCG	7.6%	30.1%
Proline	Human	E. coli
CCC	20.0%	5.4%
CCG	7.0%	20.9%

表一、同個胺基酸在不同物種間遺傳密碼子使用的偏好

現今生產蛋白有許多不同的系統，哺乳類細胞(例如: CHO)、昆蟲細胞(例如: sf9)、酵母菌(例如:pichia)以及細菌(例如:E. coli)，需依照所選擇表達系統的物種來執行序列的優化。 序列優化目的不只有提高蛋白表現及正確性，有些序列結構上較具合成難度，例如:過高或過低的GC含量，有複雜的二級結構及有polyA的延伸，這些都是重要的因素需要將原序列優化，使GC含量分布均勻，避免二級結構等來讓基因順利的表達。

Reference

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