西方墨點法（Western Blot）為一個廣泛使用的蛋白質分析方法。自樣品得到蛋白質萃取液後，經過膠體電泳分離、轉印至抗體偵測目標的過程來分析目標蛋白質的表現量，即為西方墨點法的基本流程。
以下針對不同步驟做簡要介紹，更詳細的實驗細節請見其他連結。
1. 分離（Separation）
膠體電泳（Polyacrylamide gel electrophoresis, PAGE）利用電場與膠片結構來分離膠體中的混合物樣品，進而將目標蛋白從萃取液中分離出來。膠片分離效果取決於是否使用適當的膠體、緩衝液以及樣品本身狀態習習相關。
1-1. 膠片與跑膠緩衝液（Running buffer）
膠片本身是經由Bis/ acrylamide經由APS與TEMED催化反應而交織而成，可利用不同成分與不同acrylamide比例來鑄造出不同特性的膠片來分離不同特性的目標蛋白，反應示意圖如下。
圖1. Acrylamide polymerization
主要的膠片來源有二：自鑄膠片（Handcast gel）與預鑄膠片（Precast gel）；Acrylamide比例構成可分為線性（Linear）與梯度（Gradient），不同acrylamide濃度可以針對不同分子量（Molecular Weight）範圍有最佳的分離程度；而以膠體結構來說有單一膠體構成的連續膠片（Continuous gel）與多片膠體堆疊而成的不連續膠體（Discontinuous），比較表格與示意圖如下。跑膠緩衝液的選擇與膠片的化學成分構成有關，選用配套的緩衝液才能達到最佳分離效果並讓條帶（Band）銳利清晰，也避免讓跑膠系統中的電阻過大、電解質不足導致的實驗失敗情況。
表1. 自鑄膠片與預鑄膠片
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自鑄膠片（Handcast） |
預鑄膠片（Precast） |
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結構 |
不連續膠片 |
連續膠片 |
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尺寸 |
Various |
Mini, Midi |
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膠片成份 （搭配各自緩衝液） |
Tris-Glycine |
Various |
圖2. 連續膠片與不連續膠片
(BMJ. 1989 Sep 30;299(6703):843-6.)
1-2. 樣品前處理
在分離蛋白質萃取液之前需要先經過樣品緩衝液（Sample buffer）的處理。依照實驗需求可分為維持蛋白質原本構型的原始狀態（Native condition）、經陰離子介面活性劑（Anionic detergent）處理破壞疏水結構的變性狀態（Denature condition）以及添加還原劑（Reducing agent）與加熱來完整破壞蛋白質構型的還原狀態（Reducing condition）。而樣品緩衝液中含有染色劑如溴酚藍（Bromophenol blue）或考馬斯藍（Coomassie Blue）來讓使用者能目視樣品位置。
1-3. 跑膠系統安裝與跑膠
將膠片與對應的緩衝液組裝至合適的跑膠槽（Running Tank），並選擇足夠功率的電源供應器（Power supply），參見下示意圖。
將處理好的樣品加入膠片的樣品槽（Sample well）中，請務必垂直且穩定得加入樣品並確認樣品沉入槽底部。如購買各廠牌的預鑄膠或自鑄膠試劑套組，由於各家優化的跑膠條件都不太相同，請務必至各家官網參考官方資料進行試驗。
跑膠程度以盡可能完整跑完整片膠片但樣品染劑（Dye front）不脫離膠片為基準，也建議搭配合適的蛋白質標準液（Protein ladder）來粗估蛋白質分子量位置，以避免未完整分離蛋白質樣品或是目標蛋白脫離膠體。
圖3. 西方墨點法跑膠設備組裝示意圖。
圖4. 西方墨點法跑膠起始與完成示意圖。
[起始]
[完成]
(https://youtu.be/jQQ85_5CsdE)
2. 轉印（Transfering）
樣品完成分離後，利用電場將膠體中的蛋白質轉印至轉印膜（Transfer membrane）上，除了可讓實驗操作較容易外，也能讓抗體（Antibody）有較好的辨識能力。常用的轉印膜有2種主要類型：硝酸纖維素（Nitrocellulose, NC）與聚偏二氟乙烯（Polyvinylidene difluoride, PVDF）。兩者都對蛋白質有高度親合力（Protein-binding affinity），通常PVDF有著比NC更高的結合能力（Binding capacity），但PVDF膜在使用前需要用甲醇或乙醇浸潤而NC膜較易碎。而孔徑則以小分子量（£ 20 kDa）適用的 0.2 mm 與通用的0.45 mm 兩種為主。
轉印系統有三種：濕式（Wet）、半乾式（Semi-dry）與乾式（Dry），濕式將裝有轉印三明治（Transfer sandwich）的轉印模組（Transfer module）泡在緩衝液裡且可依照不同類型膠片搭配不同轉印緩衝液（Transfer buffer）達最佳轉印效果，且若實驗需求需要長時間轉印也可將轉印系統置於冷房或冰浴。半乾式僅使用少量緩衝液潤濕轉印三明治，利用大面積電極板進行轉印，轉印時間較濕式短但不適合用於大分子量蛋白轉印。乾式是用特殊材料與電極片配合指定設備在短時間內完成轉印且不需要準備轉印緩衝液。
圖5. 轉印三明治示意圖。
[濕式]
[半乾式]
[乾式]
(Thermo Fisher: WesternBlot Handbook)
3. 偵測（Detection）
3-1. 封閉緩衝液（Blocking buffer）
將轉印完成的轉印膜浸泡於封閉緩衝液中填補轉印膜的空隙，以避免後續抗體被轉印膜吸附而導致的非專一性結合（Non-specific binding），浸泡過程中需緩慢搖動以利轉印膜均勻封閉。常用的封閉緩衝液有2 – 5 %脫脂奶粉（Skim milk）、2 – 3 %牛血清蛋白（bovine serum albumin, BSA）與1 %酪蛋白（Casein）以含介面活性劑的磷酸鹽緩衝液（Phosphate-buffered saline with Tween-20, PBST）或三羥甲基胺鹽緩衝液（Tris-buffered saline with Tween-20, TBST）配製而成。各大廠牌也提供即開即用（Ready-to-use）配方的封閉液與無蛋白封閉緩衝液，讓使用者可以依照研究目標蛋白特性來選擇適用產品。
3-2. 洗滌緩衝液（Wash buffer）
由於轉印膜會在多種免疫化學試劑（Immunochemical reagents）中轉換與孵育（Incubate），各個步驟間需要洗滌來去除多餘的試劑，進而減少非專一性訊號及背景訊號。常用的洗滌緩衝液有磷酸鹽緩衝液（Phosphate-buffered saline, PBS）或三羥甲基胺鹽緩衝液（Tris-buffered saline, TBS），添加0.05% – 0.5% 介面活性劑如聚山梨醇酯-20（Tween-20）來去除非專一性結合。使用洗滌緩衝液的主要時間點在一、二級抗體孵育之間以及二抗孵育完成後，常用流程為洗三次，每次5 – 10分鐘。
3-3. 一級抗體（Primary antibody）
封閉完的轉印膜即可移至含有具專一性結合能力（Specific-binding affinity）的目標蛋白抗體進行結合。選擇抗體時需特別注意抗體的反應物種（Species Reactivity）需與樣品來源相同，才具有穩定且專一的結合能力。另外也建議挑選已有原廠認可能應用於西方墨點法之產品，同時參考官方提供的建議濃度或是參考學術論文使用濃度配製於封閉液中。
3-4. 二級抗體（Secondary antibody）
若直接以經過標記的一級抗體進行訊號偵測，會因為訊號不足而造成難以偵測且不易提高訊雜比（Signal noise ratio, SNR），因此轉而將標記接到二級抗體上來放大訊號進而改善結果呈現，如下圖示意圖所示。
因此經過一級抗體處理且完成洗滌流程的轉印膜，移至對應一級抗體物種的二級抗體與其結合以利後續偵測。常用的二級抗體標記物為辣根過氧化物酶（Horseradish peroxidase, HRP）、鹼性磷酸酶（Alkaline phosphatase, AP）或螢光物質。
圖6. 抗體結合示意圖
[化學冷光]
[螢光]
(Thermo Fisher: WesternBlot Handbook)
3-5. 呈色
目前主要的西方墨點法呈色方法有二種：化學冷光（Chemiluminescent）與螢光（Fluorescent）。
如果以冷光系統來說，二級抗體上接的是HRP或AP酵素，在完成二抗洗滌後，利用特定受質（Substrate）與酵素反應進而產生化學冷光再藉由X光片（X-ray film）或是影像擷取系統等設備進行冷光偵測。
如果選用接了螢光物質的二級抗體則可以省去受質反應的步驟，但需要有螢光訊號擷取設備才能得到實驗結果。
圖7. 化學冷光擷取示意圖 （反白處理）
圖8. 螢光擷取示意圖
(Thermo Fisher: WesternBlot Handbook)
整體而言，西方墨點法是個廣泛使用且歷史悠久的實驗技術，是相當具代表性的實驗，而隨著時間的推進，越來越多為西方墨點法優化的設備與試劑讓使用者可以在更短時間內得到更具代表性的實驗結果。
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